1. Ziel der Arbeit:
Unter Verwendung des CAM-Modells wird die Chemotherapie Sensitivität der Pankreaskarzinomzelllinien MIA PaCa-2 und BxPC-3, sowie von zirkulierenden Tumorstammzellen und operativ entnommenen Gewebeproben erkrankter Patienten untersucht werden. Der Therapieerfolg wird anhand histologischer, immunhistologischer und Fluoreszenz-basierter Untersuchungen ermittelt und ermöglicht somit die Aufstellung individualisierter Therapieempfehlungen für den Patienten.
Ziel ist es, in dem Zeitraum zwischen Operation und Beginn der Chemotherapie, mithilfe der Blut- und Gewebeproben, eine auf den Patienten abgestimmte individualisierte Chemotherapie Empfehlung zu erstellen, und somit die Prognose und die Aussicht auf Remission verbessern zu können.
2. geplante Methoden und Mittel
Studienteilnehmer:
Patient/innen der Klinik und Poliklinik für Chirurgie des Universitätsklinikums Regensburg, welche für eine Operation in Frage kommen und der Teilnahme an der Studie eingewilligt haben, werden in die Studie eingeschlossen. Den Patient/innen wird prä-, intra- und postoperativ Blut abgenommen, welches von der simfo GmbH auf das Vorhandensein von Tumorsphären hin untersucht wird. Das operativ entnommene Gewebe, welches nicht zum Zwecke der Diagnostik benötigt wird, wird anschließend auf der CAM inokuliert.
MTT Assay, Zellkultur & Tumorsphären:
Die beiden Pankreaskarzinomzelllinien MIA PaCa-2 und BxPC-3, sowie die aus Patientenblut gewonnenen Tumorsphären, werden zunächst per Zellkultur herangezogen und anschließend in Matrigel gemischt auf die CAM aufgebracht. Die therapeutische Behandlung der entstandenen Zellpellets erfolgt topisch, in vorher mittels MTT Assay ermittelten Konzentrationen.
CAM-Modell:
Die Chorioallantoismembran entsteht während der Embryonalentwicklung aus der Fusion von Chorion- und Allantoismembran. Die CAM ist stark vaskularisiert, nicht innerviert, immun defizient und aufgrund ihrer Lage unterhalb der Eierschale leicht erreichbar. Zur Nutzung der CAM als 3D-in-vivo-Tumormodell werden bebrütete Hühnereier gewaschen, desinfiziert und anschließend bei 37°C und 65% Luftfeuchtigkeit inkubiert. An Tag 4 werden die Eier gefenstert und mit Leukosilk verschlossen. Zwischen Tag 8-10 erfolgt die Inokulation des Tumormaterials. Primärgewebe wird direkt auf die CAM aufgetragen, Sphären werden vor Implantation mit Matrigel gemischt. In den folgenden sieben Tagen erfolgt die intravenöse und topische Applikation der Chemotherapeutika. Nach Abschluss des Versuchs werden die Hühnerembryonen mit flüssigem Stickstoff versetzt.
IKOSA & LASCA Messungen:
LASCA (Laser Speckle Contrast Analysis) stellt ein laserbasiertes bildgebendes Verfahren zur Messung der mikrozirkulatorischen Blutperfusion da. Die Messungen beruhen auf der Kontrast Analyse des sogenannten Speckle-Musters, welches durch die Rückstreuung der Laserstrahlen von der Oberfläche sich bewegender Erythrozyten entsteht. IKOSA ist eine auf Deep Learning basierende Software, welche vom Mikroskop aufgenommene Bilder der CAM auf die Ausprägung des vaskulären Netzwerkes hin untersucht und die Daten quantifiziert. Die Perfusionsmessung der auf die CAM aufgebrachten Tumoren erfolgt am Tag der Inokulation sowie am Entnahmetag.
Histopathologie:
Die Tumoren werden von der CAM entnommen, in 4% PFA fixiert, eingebettet, geschnitten und anschließend gefärbt (HE, PAS, KI67, CD31).
